部位保护化学醋酸成分作用乙酯研究及其睡菜神经三

化合物13：黄色针晶，睡菜神经EI-MS：m/z 624 +，醋酸成分分子式为C28H32O16。乙酯研究1H NMR (400 MHz,部位保护 DMSO-d6) δ: 7.87 (1H, s, H-2′), 7.53 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6′), 6.93 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.41 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, s, H-6), 5.45 (1H, d, J = 7.2 Hz, Glc, H-1′′), 4.44 (1H, br s, Rha, H-1′′′), 3.27 (3H, s, -OCH3), 0.99 (3H, d, J = 6.2 Hz, Rha C-6′′′), 0.99 (3H, d, J = 6.1 Hz, Rha, H-6′′′)；13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.3 (C-4), 164.5 (C-7), 161.2 (C-5), 157.1 (C-2), 156.1 (C-9), 149.1 (C-4′), 147.5 (C-3′), 133.1 (C-3), 122.4 (C-6′), 121.2 (C-1′), 115.4 (C-5′), 113.4 (C-2′), 103.4 (C-10), 102.2 (C-1′′), 101.0 (C-1′′′), 99.6 (C-6), 94.4 (C-8), 76.7 (C-3′′), 76.1 (C-5′′), 74.5 (C-2′′), 72.1 (C-4′′′), 70.9 (C-2′′′), 70.7 (C-4′′), 70.3 (C-3′′′), 68.5 (C-5′′′), 67.2 (C-6′′), 56.0 (-OCH3), 18.0 (C-6′′′)。以上数据与文献报道一致，化学故鉴定该化合物为槲皮素-3-O-芸香糖苷。作用

化合物14：黄色粉末，睡菜神经EI-MS：m/z 222 +，醋酸成分分子式为C13H18O3。乙酯研究1H NMR (400 MHz,部位保护 CD3OD) δ: 7.01 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7), 6.46 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8), 5.97 (1H, m, H-4), 2.65 (1H, d, J = 17.8 Hz, H-2), 2.32 (3H, s, H-10), 1.91 (3H, d, J = 1.4 Hz, H-13), 1.07 (3H, s, H-12), 1.01 (3H, s, H-11)；13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 199.2 (C-9), 199.0 (C-3), 163.1 (C-5), 147.0 (C-7), 130.4 (C-8), 126.5 (C-4), 78.4 (C-6), 49.2 (C-2), 41.7 (C-1), 26.3 (C-10), 23.4 (C-12), 22.1 (C-11), 17.5 (C-13)。以上数据与文献报道一致，化学故鉴定该化合物为去氢吐叶醇。作用

化合物15：无色油状物，睡菜神经EI-MS：m/z 224 +，醋酸成分分子式为C13H20O3。乙酯研究1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 5.70 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7), 5.63 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8), 5.78 (1H, br s, H-4), 4.19 (1H, d, J = 6.4 Hz, H-9), 2.35 (1H, d, J = 16.6 Hz, H-2a), 2.05 (1H, d, J = 16.6 Hz, H-2b), 1.82 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-13), 1.11 (3H, s, H-10), 0.93 (3H, s, H-11), 0.91 (3H, s, H-12)；13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.5 (C-3), 164.5 (C-5), 135.8 (C-7), 127.9 (C-8), 125.5 (C-4), 77.9 (C-6), 65.9 (C-9), 49.4 (C-2), 41.0 (C-1), 24.1 (C-10), 23.7 (C-12), 23.1 (C-11), 19.0 (C-13)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为布卢门醇A。

化合物16：白色无定形粉末, EI-MS：m/z 196 +，分子式为C11H16O3。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.73 (1H, s, H-7), 4.18 (1H, m, H-3), 2.42 (1H, dt, J = 14.0, 2.8 Hz, H-4b), 2.01 (1H, dt, J = 14.5, 2.8 Hz, H-2b), 1.77 (3H, s, H-11), 1.75 (1H, dd, J = 14.0, 3.8 Hz, H-4a), 1.51 (1H, dd, J = 14.5, 3.8 Hz, H-2a), 1.47 (3H, s, H-9), 1.27 (3H, s, H-10)；13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 185.4 (C-6), 174.4 (C-8), 113.2 (C-7), 88.8 (C-5), 67.2 (C-3), 47.7 (C-2), 46.3 (C-4), 37.2 (C-1), 30.7 (C-10), 27.1 (C-11), 26.6 (C-9)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为黑麦草内酯。

化合物17：黄色油状物，EI-MS：m/z 196 +，分子式为C12H20O2。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.75 (1H, dd, J = 7.1, 1.3 Hz, H-3), 5.88 (1H, dd, J = 17.2, 10.7 Hz, H-7), 5.21 (1H, dd, J = 17.2, 1.4 Hz, H-8a), 5.08 (1H, dd, J = 10.7, 1.4Hz, H-8b), 3.71 (3H, s, -OCH3), 2.19 (2H, m, H-4), 1.81 (3H, s, H-10), 1.62 (2H, m, H-5), 1.28 (3H, s, H-9)；13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 168.7 (C-1), 144.4 (C-7), 142.1 (C-3), 127.6 (C-2), 112.2 (C-8), 73.1 (C-6), 51.7 (-OCH3), 40.7 (C-5), 27.9 (C-9), 23.5 (C-4), 12.2 (C-10)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为 (E)-6-羟基-2,6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯。

化合物18：白色无定形粉末，EI-MS：m/z 432 +，分子式为C19H28O11。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.15 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-6), 7.03 (1H, d, J = 2.9 Hz, H-2), 6.95-7.02 (2H, m, H-4, 5), 4.86 (1H, d, J = 6.6 Hz, Glc, H-1′), 4.72 (1H, d, J = 1.2 Hz, Rha, H-1′′), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 1.21 (3H, d, J = 5.2 Hz, Rha, H-6′′)；13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 150.7 (C-3), 147.8 (C-1), 124.3 (C-2), 122.2 (C-5), 118.5 (C-6), 113.5 (C-4), 102.5 (C-1′), 102.2 (C-1′′), 77.9 (C-3′), 76.8 (C-5′), 75.0 (C-2′), 74.1 (C-3′′), 72.3 (C-4′′), 72.2 (C-2′′), 71.5 (C-4′), 70.1 (C-5′′), 67.9 (C-6′), 56.8 (-OCH3), 17.9 (C-6′′)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为3-甲氧基苯酚-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物19：浅黄色粉末，EI-MS：m/z 134 +，分子式为C7H6N2O。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.71 (2H, s, 2×NH), 7.04-6.97 (4H, m, H-5, 6, 7, 8)；13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 155.3 (C-2), 129.7 (C-4, 9), 120.4 (C-6, 7), 108.5 (C-5, 8)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为2-羟基苯并咪唑。

化合物20：无色针状晶体，EI-MS：m/z 182 +，分子式为C9H10O4。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.79 (1H, s, 1-CHO), 7.13 (2H, s, H-2, 6), 3.91 (6H, s, 3, 5-OCH3)；13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 190.5 (C-1), 147.1 (C-3, 5), 141.0 (C-4), 128.2 (C-1), 106.8 (C-6), 56.3 (3-OCH3, 5-OCH3)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为syringaldehyde。

化合物21：无色粉末，EI-MS：m/z 138 +，分子式为C8H10O2。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.25～7.38 (5H, m, H-2, 3, 4, 5, 6), 4.67 (1H, dd, J = 7.4, 4.7 Hz, H-1′), 3.64 (2H, m, H-2′)；13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 143.4 (C-1), 129.1 (C-3, 5), 128.4 (C-4), 127.5 (C-2, 6), 76.1 (C-1′), 68.5 (C-2′)。以上数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为1-苯基-1,2-乙二醇。

3.2 皮质酮对PC12细胞损伤的浓度选择

实验结果显示，皮质酮对PC12细胞的损伤程度随浓度呈依赖性上升，450、550、650、750、850、950、1050、1150 μmol/L皮质酮作用PC12细胞48 h后，其细胞存活率分别为88.81±2.21%、77.07±4.21%、52.47±0.99%、44.78±0.95%、34.26±0.91%、26.96±3.36%、12.32±0.22%、13.21±2.02%。见图1。

本结果验证了一定浓度的皮质酮确实能损伤神经元，650 μmol/L皮质酮作用48 h对高分化PC12细胞的抑制率接近50%，故选择以体外650 μmol/L皮质酮48 h作用于PC12细胞以模拟焦虑症神经细胞损伤状态，构建抗焦虑活性成分体外细胞筛选模型。

3.3 单体化合物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

实验结果显示，与650 μmol/L皮质酮组相比，化合物1、2、3、4、5、7、9、10、11、15、16、17与650 μmol/L皮质酮共同作用PC12细胞48 h后，细胞存活率分别提高至92.29±2.31%、90.74±1.61%、91.62±1.83%、63.11±2.30%、61.01±1.21%、101.18±1.56%、105.23±1.11%、67.77±1.89%、65.66±1.06%、75.94±0.24%、64.39±1.47%、72.88±1.82%。苯丙素、木脂素、黄酮、单萜类均有不同程度的促进650 μmol/L诱导的PC12细胞增殖的作用。其中，4-O-咖啡酰奎尼酸甲酯（1）、绿原酸甲酯（2）、绿原酸（3）、肿柄雪莲苷（7）、苏式-(7R,8R)-愈创木基丙三醇-8-香草醛醚（9）促进650 μmol/L诱导的PC12细胞保护作用最为显著，实验结果见图2。

4 讨论

本研究从睡菜全草醋酸乙酯部位分离并鉴定得到21个化合物，包括3个苯丙素类（1～3），2个香豆素类（4和5），6个木脂素类（6～11），2个黄酮类（12和13），4个单萜类（14～17），4个其他类（18～21）。同时考察了21个化合物对皮质酮诱导损伤的PC12细胞的保护作用。结果表明化合物1、2、3、7、9表现出显著的保护作用，化合物4、5、10、11、15、16、17表现出中等的保护作用。

北五味子作为我国传统的安神药，近年来的研究报道了北五味子木脂素具有显著的中枢抑制与安神作用。合欢皮经研究也证明其抗焦虑的主要活性成分是 (-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷，其作用机制可能与抑制PC12细胞线粒体凋亡有关。后续将进一步探索睡菜主要活性成分对皮质酮损伤的PC12细胞的抗凋亡及保护作用机制，阐明睡菜抗焦虑活性的药效物质基础。

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